上一章完成以后我们已经有了一个nnaa_library.mdb其中保存了 CYC4、AZE2 等自定义非天然氨基酸。但此时 MOE 只知道“这个残基长什么样。”它还不知道“这个残基接到蛋白主链以后侧链通常可以采用哪些构象。”这就是 Rotamer Library 要解决的问题。Rotamer 到底是什么氨基酸侧链通常可以围绕 χ1、χ2 等可旋转键发生旋转。理论上这些二面角可以连续变化但实际上由于空间位阻键角限制分子内部能量局部相互作用某些侧链构象会比其他构象更稳定。这些常见、合理的侧链构象就可以理解为Rotamer。天然氨基酸已经有成熟的 Rotamer 数据。但对于我们刚刚自己构建的 CYC4、AZE2MOE 并没有现成的构象信息因此需要重新建立。第一步从 NNAA Database 生成 Rotamer Library打开前面建立的nnaa_library.mdb然后在 Database Viewer 中选择Compute → Build Rotamer Library...这一步会根据数据库中的非天然氨基酸结构对侧链构象进行采样并生成新的 Rotamer Database。输出数据库可以设置为nnaa_rotamers.mdb示例中为了缩短计算时间将Iterations 1000然后开始计算。这里的 Iterations 可以简单理解为在构象空间中进行采样和搜索的次数。迭代次数越高通常意味着对侧链构象空间探索得更加充分但计算时间也会增加。为什么一个氨基酸会产生四种状态计算完成后nnaa_rotamers.mdb会自动打开。这里会发现一个很有意思的现象同一个非天然氨基酸并不是只有一条记录。而是会生成四种不同环境下的形式PolymerN-terminal chargedC-terminal chargedFree zwitterionic amino acid。为什么要这么做因为同一个氨基酸处在蛋白链内部、N 端、C 端和游离状态时化学环境并不相同。例如Polymer 状态表示这个残基已经通过肽键连接在蛋白或肽链内部。而Free zwitterion则对应游离氨基酸状态。而N-terminal charged和C-terminal charged分别代表他们N端和C端的氨基酸残基状态。对于后续肽设计来说最常使用的通常是Polymer 状态因为我们更关心的是当 CYC4 被插入肽链中以后它的侧链有哪些合理构象。第二步直接查看 CYC4 的侧链构象接下来可以双击CYC4 Polymer → mol:conf加载对应的 conformers。这样CYC4 的多个候选侧链构象会同时显示在 MOE 三维窗口中。这一张图其实非常值得仔细看。因为它直观展示了 Rotamer Library 的真正意义不是给残基保存一个固定结构而是保存一组可能的侧链构象。以后当 CYC4 被突变到某个肽链位置时MOE 就可以从这些构象中寻找更适合当前局部环境的 side-chain placement。第三步把新的 Rotamer Library 加入 MOE生成数据库之后还没有结束。因为此时nnaa_rotamers.mdb 虽然存在但 MOE 的 Protein Builder 并不知道要去读取它。因此还需要进入Protein Defaults把新生成的nnaa_rotamers.mdb加入 Rotamer Libraries 列表。添加完成以后可以使用Validate...检查数据库是否能够被正确找到。如果路径或文件存在问题这里会出现 warning。这一操作完成以后自定义 Rotamer Library 才真正进入 MOE 的蛋白设计环境。当这里下面出现了代表添加成功了。到这里我们到底完成了什么现在可以把整个过程串起来设计非天然氨基酸结构↓保存到 nnaa_library.mdb↓Build Rotamer Library↓生成 nnaa_rotamers.mdb↓加入 Protein Defaults↓Protein Builder / Protein Design 调用也就是说我们已经从“画一个新的氨基酸”走到了让 MOE 真正知道这个氨基酸在蛋白环境中可能怎么摆放。这一步非常关键。因为后面的 Protein Design 并不是简单把一个残基替换进去而是还需要重新寻找合理的侧链构象。本篇小结自定义非天然氨基酸要真正进入肽设计流程需要两个层次的信息第一层化学结构是什么。这由nnaa_library.mdb保存。第二层合理的侧链构象有哪些。这由nnaa_rotamers.mdb保存。完成 Rotamer Library 并加入 Protein Defaults 后CYC4、AZE2 才真正具备进入自动化设计流程的条件。下一篇我们将正式从“手工设计”进入“批量设计”如何利用 Protein Design 和 Residue Scan同时测试多个位点、多个天然和非天然氨基酸突变并自动计算 affinity 和 stability。